Multiphotonenmikroskopie
Als Spezialfall der Fluoreszenzmikroskopie wird bei der Multiphotonenmikroskopie durch nichtlineare optische Effekte die Fluoreszenzanregung nur auf den Fokuspunkt des Lasers begrenzt. Dadurch lässt sich eine verbesserte Auflösung erreichen. Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist die höhere Eindringtiefe in die Probe durch langwelliges Licht und ein stark vermindertes Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe.
Um die notwendigen nichtlinearen optischen Effekte zu generieren, werden kurze fs-Pulse mit hohen Peak-Leistungen benötigt, die in der Probe im Fokuspunkt eine ausreichend hohe Photonendichte erzeugen. So werden zwei oder mehr Photonen gleichzeitig absorbiert, die ein höheres Energieniveau anregen. Im Gegensatz zur normalen Fluoreszenzmikroskopie hat das Fluoreszenzlicht eine wesentlich kürzere Wellenlänge als das Anregungslicht. Durch die nichtlineare Anregung ist keine Lochblende notwendig, um Licht außerhalb des Fokuspunkts zu filtern, da nur im Fokuspunkt genügend hohe Intensitäten eine Fluoreszenz anregen. Abschließend rastert der Fokuspunkt mit einem Scanner über die Probe und der Computer setzt alle Aufnahmen zu einem Bild zusammen. Die gängigste Variante ist die Anregung mit zwei Photonen. Bei dieser 2-Photonenmikroskopie haben sich die Anregungswellenlängen 920 nm und 1064 nm etabliert, sodass viele Nutzer die üblicherweise eingesetzten durchstimmbaren Titan:Saphir Laser auf diese Wellenlängen beschränken. Daher setzen sich in den letzten Jahren die Femtosekunden-Faserlaser mit fester Wellenlänge durch, die speziell für die 2-Photonenmikroskopie entwickelt werden und somit optimal auf die Anwendung abgestimmt sind. Diese Laser sind nicht nur günstiger und kompakter als Titan:Saphir Laser, sondern zudem praktisch wartungsfrei. Insbesondere in den Neurowissenschaften hat sich die Multiphotonenmikroskopie zu einer wichtigen Technik entwickelt. In vielen Fällen wird diese Anwendung mit einem zweiten Laser kombiniert, der Neuronen gezielt anregen oder deaktivieren kann (Optogenetik).
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